Establishment of an analytical asymmetrical flow field-flow fractionation (AF4) method for characterization and quantification of bionanoparticles

Catarina Sousa Neves Maia

Key information

Authors:

Catarina Sousa Neves Maia (Catarina Sousa Neves Maia)

Supervisors:

Ana Margarida Nunes da Mata Pires de Azevedo (Ana Margarida Nunes da Mata Pires de Azevedo); Astrid Dürauer

Published in

December 15, 2023

Abstract

Nesta dissertação, a técnica analítica de fracionamento de fluxo de campo de fluxo assimétrico (AF4) é explorada e avaliada para caracterizar e quantificar bionanopartículas, nomeadamente, HIV-1 gag VLPs produzidos em células de inseto, através do sistema de expressão Baculovírus, e em células CHO. Antes de analisadas por AF4, as VLPs foram purificadas usando dois passos cromatográficos, nomeadamente, uma cromatografia em modo negativo usando uma resina com tecnologia core-shell, seguida por uma cromatografia de afinidade com heparina. Estabeleceu-se uma correlação entre a análise de rastreamento de nanopartículas (NTA) e a AF4 para a determinação da concentração de partículas, mostrando que a AF4 é uma alternativa potencial à NTA, na análise de populações de partículas polidispersas. A recuperação analisada pela AF4 foi avaliada relacionando a concentração de partículas com o sinal de dispersão de luz a 90º (LS90), medido pelo detetor de dispersão de luz multiângulo (MALS). A AF4 destacou-se, por comparação ao NTA, na determinação de tamanhos de partículas inferiores a 50 nm. Analisou-se o efeito do pH do tampão (6, 7 e 8) no desempenho da AF4, observando-se que a recuperação depende da presença de populações específicas na amostra e que valores de pH ente 7 e 8 permitem obter recuperações superiores às obtidas a pH 6. Globalmente, os resultados indicam que a AF4 em combinação com detetores apropriados (MALS, Difração dinâmica de luz e UV) é uma técnica adequada para caracterização e quantificação de bionanopartículas permitindo acelerar o desenvolvimento do processo de purificação de VLPs. In this study, the analytical asymmetric field-flow fractionation (AF4) technique is explored and evaluated to characterize and quantify bionanoparticles, in particular, HIV-1 gag VLPs, produced either via the Baculovirus expression system in insect cells, or in CHO cells. VLPs were purified using a two-step chromatography process, a flow-through step using a core-shell resin followed by a Heparin affinity chromatography step, before used for AF4 experiments. A correlation between Nanoparticle Tracking Analysis (NTA) and AF4 was established for particle concentration determination, showing that AF4 is a potential alternative to NTA for downstream process analytics, especially when dealing with polydisperse particle populations. AF4 recovery was evaluated by relating the particle concentration to the Light scattering 90º (LS90) signal measured by the Multi Angle Light Scattering (MALS) detector. AF4 has also shown to be more accurate than NTA for the measurement of small particles (< 50 nm) radii. A buffer screening was carried out to examine the influence of buffer pH on AF4 performance regarding particle recovery, using phosphate buffer salina (PBS) at pH values of 6, 7, and 8. The findings indicate that pH-dependent recoveries depend on specific particle populations in the sample, with pH 6 resulting in lower recoveries and pH 7/7.2 and 8 being optimal choices. Finally, the results indicate that AF4 when combined with appropriate detectors (MALS, Dynamic Light Scattering and UV) is a suitable technique to characterize and quantify bionanoparticles, thus accelerating their downstream process development.